Введение
Грецкий орех (Juglans regia L.) — один из самых распространенных орехов в мире. В настоящее время грецкий орех выращивают в коммерческих целях в Южной Европе, Северной Африке, Восточной Азии, США и западной части Южной Америки. Мировое производство цельного грецкого ореха в 2021 году составило около 2,31 × 106 т. Китай является ведущим мировым производителем, а за ним следуют США, Иран, Турция, Украина, Румыния, Франция и Индия, но производство в других странах, таких как Чили и Аргентина, увеличилось стремительно в последние годы [1].
Грецкий орех является видом, имеющим большое значение в Центральной Азии, где орехи собирают с дикорастущих насаждений, приусадебных участков и коммерческих плантаций, которые значительно различаются по размеру и степени управления. Орехи собирают для домашнего потребления, продажи на местных придорожных лотках и рынках, а также для отправки в другие города. Деревья грецкого ореха в дальнейшем используются для производства широкого спектра продуктов из-за их высококачественной древесины. Листья, кора и другие части растений используются в лечебных целях, а деревья выращивают и ухаживают за ними в целях сохранения почвы [2].
Agrobacterium tumefaciens — вездесущая почвенная бактерия, обладающая уникальным молекулярным механизмом, который может опосредовать перенос определенного сегмента бактериальной ДНК в геномы клеток растений, грибов и животных. Хотя важность горизонтального переноса генов агробактерий-грибов и агробактерий-животных неизвестна, патогенез агробактерий-растений хорошо изучен [3]. Несмотря на то, что A. tumefaciens имеет самый широкий круг хозяев из всех патогенов растений, с более чем 600 охарактеризованными растениями-хозяевами, болезнь корончатого галла, как правило, представляет собой серьезную сельскохозяйственную проблему только для фруктовых и ореховых деревьев, винограда и некоторых декоративных растений [4]. У этих культур корончатый галл может вызвать большие экономические потери из-за выбраковки больного саженца, снижения продуктивности растений пораженных галлом и повышенной восприимчивости к условно-патогенным микроорганизмам [5].
Цель исследования
Основное внимание в борьбе с корончатым галлом обычно уделяется уничтожению A.tumefaciens посредством фумигации почвы, фитосанитарии и/или биоконтроля (особенно Agrobacterium radiobacter K84) [6]. Несмотря на то, что в ряде случаев эти меры были успешными в борьбе с болезнью корончатого галла, они не обеспечили последовательной и эффективной борьбы с болезнями многих сельскохозяйственных культур, включая грецкий орех. Очень важно изучить и проанализировать механизм этого процесса и имеющиеся на сегодняшний день методы, чтобы разработать новые методы борьбы с этим заболеванием грецкого ореха. В данной статье анализируются механизм корончатого галла грецкого ореха, влияние болезни на плантации грецкого ореха, методы, имеющиеся на сегодняшний день и которые могут быть использованы в будущем для борьбы с этим заболеванием.
Влияние на плантации грецкого ореха
Основным признаком корончатого галла грецкого ореха является образование опухолей на короне подвоя грецкого ореха. Корончатый галл был назван одним из основных заболеваний, поражающих питомники и плантации во всех регионах, где выращивают грецкий орех [7]. При наблюдении было выяснено, что корончатый галл снижает урожайность на 12-25% в первые четыре года в молодых плантациях грецкого ореха [8]. Если их не лечить, галлы могут убить даже очень большие деревья. Кроме того, галлы являются местом проникновения грибов, и других патогенов, вызывающих гниение древесины, которые могут нанести дополнительный ущерб дереву. Галлы также служат средой обитания для ряда различных насекомых, которые могут вызывать вторичные повреждения или даже действовать как переносчики других патогенов. После попадания в почву A. tumefaciens может выживать в течение многих лет даже при отсутствии растения-хозяина [9]. Интересно, что было показано, что A. tumefaciens систематически перемещается по деревьям грецкого ореха, что также усложняет процесс обеспечения чистоты поголовья. Например, системно инфицированные деревья могут проявлять симптомы только через несколько месяцев, во время полевой прививки или после повреждения при посадке. Эта возможность делает крайне важным уделять большое внимание уменьшению или устранению ранней инфекции A. tumefaciens, чтобы избежать разрушительных вспышек корончатого галла на молодых деревьях спустя месяцы или годы [10].
Корончатый галл на плантациях грецкого ореха в Узбекистане
Средняя Азия, включая Узбекистан, является одним из центров происхождения грецкого ореха. Несмотря на это, в Узбекистане практически не проводились научно-исследовательские работы в области технологии выращивания грецкого ореха, борьбы с болезнями и вредителями, семеноводства. В 2017-2022 годах были заложены плантации на площади 14 000 га на основе всемирно известных сортов грецкого ореха, в том числе сорта Чандлер, а в качестве подвоя в 80% саженцах использован Парадокс. Однако эти сорта не смогли полностью адаптироваться к климату Узбекистана, то есть процент поражения ранними осенними заморозками и различными болезнями, в том числе корончатым галлом, показал высокий показатель. Согласно исследованиям, проведенным на плантациях Джамбайского, Булунгурского, Пайарикского районов Самаркандской области и Галлааральского района Джизакской области, в 2020 году процент заражения корончатым галлом в плантациях, состоящих из 3-4-летних сеянцев, составил в среднем 30-40%, а в 2022 году этот показатель достиг 60% -70%. Учитывая, что корончатый галл у молодых деревьев вызывает резкое снижение урожайности [8] и другие вторичные заболевания [9], это означает необходимость применения в этих насаждениях мер против Agrobacterium tumefaciens.
Механизм вирулентности корончатого галла.
Опухолеиндуцирующая плазмида (pTi) необходима для вирулентности A. tumefaciens. Потеря pTi приводит к потере патогенности. Плазмида Ti содержит гены, участвующие в репликации, конъюгации и катаболизме опинов [11,12]. Кроме того, плазмида Ti содержит область вирулентности (vir), которая содержит гены, кодирующие систему секреции типа IV, другие эффекторные белки вирулентности и область транспортной ДНК или Т-ДНК. Т-ДНК содержит две группы генов: онкогены и гены биосинтеза опина, которые экспрессируются, когда Т-ДНК встраивается в геном хозяина. Экспрессия этих генов приводит к развитию галлов или опухолей, т.е. фенотипу корончатых галлов [13,14]. Плазмиды Ti делятся на группы в зависимости от типов продуцируемых ими опинов, таких как октопин, нопалин, агропин, маннопин и т. д. Эти опины являются продуктами конъюгации аминокислот с кетокислотами или сахарами и, как полагают, служат источником углерода и азота для A. tumefaciens [15].
Процесс патогенеза A. tumefaciens широко изучен в некторых странах[16,17,18]. Подвижность, хемотаксис и прикрепление являются важными прединфекционными процессами вирулентных штаммов A. tumefaciens [19]. Ризосфера богата сахарами, аминокислотами и другими соединениями, которые служат сигнальными молекулами для A. tumefaciens в этом прединфекционном процессе. Кроме того, экссудаты из ран растений содержат сигнальную молекулу, ацетосирингон (AС), которая может восприниматься двухкомпонентной регуляторной системой VirA/VirG штаммов A.tumefaciens. VirA представляет собой трансмембранную гистидинкиназу и имеет С-концевой цитоплазматический домен, который аутофосфорилируется AС. Затем фосфорилированный VirA активирует белок VirG в цитоплазме. Белок VirG, который является регулятором ответа, модулирует нисходящую передачу сигнала и экспрессию генов. Двухкомпонентная регуляторная система VirA/VirG выполняет многофункциональную роль. Когда концентрация ацетосирингона низкая, он опосредует хемотаксис, тогда как при высоких концентрациях он инициирует экспрессию оперона vir. Оперон vir содержит гены, кодирующие систему секреции IV типа, ответственную за перенос Т-ДНК в растительные клетки, где она стабильно встраивается в геном растения [15]. Как только Т-ДНК встраивается в геном растения, онкогены и гены биосинтеза опина в Т-ДНК экспрессируются системой транскрипции и трансляции растения [20]. Гормоны растений, кодируемые онкогенами, вызывают неконтролируемую пролиферацию растительных клеток, что приводит к образованию опухолей. В то же время продукты опина гены биосинтеза продуцируют опины, которые служат источниками углерода и азота для штаммов A. tumefaciens, несущих гены специфичного катаболизма опинов на той же плазмиде Ti [15,20,21]. Опины также служат индукторами, способствующими конъюгации плазмид Ti среди агробактерий, что приводит к появлению дополнительных штаммов A. Tumefaciens, которые способны воспользоваться имеющимися опинами. При сравнении различных генов опинового типа плазмиды Ti и индуцирующие корень (Ri) имеют общие гомологичные участки ДНК, которые опосредуют вирулентность. Гомологические области содержат необходимые гены для патогенеза, например, virD1, virD2, virB гены T4SS, virE2; virC; и virC2, все они необходимы для трансформации. Напротив, несущественные факторы, такие как virD3, virD5, virE3, virF, virH, virJ, virK, virL и virM, различаются у разных штаммов [22, 23]. Эти незаменимые и заменимые гены были дополнительно определены на основе исследования мутантов A. tumefaciens, введенных в восприимчивым раненым хозяевам. Кроме того, известно, что хромосомы и pAt несут несущественные гены, участвующие в патогенезе
A. tumefaciens, такие как chvE, chvH и chvI. Предполагается также, что некоторые из этих генов опосредуют адаптацию хозяина. Также разумно предположить, что эти несущественные генетические элементы могут способствовать видимой изменчивости вирулентности штаммов A. tumefaciens в природе.
Образование корончатого галла включает взаимодействие между генами как вирулентных штаммов A. tumefaciens, так и восприимчивых растений-хозяев [22]. Хотя pTi несет ключевые гены, которые опосредуют корончатый галл, в хромосомах обнаруживаются и другие гены вирулентности, такие как гены chv [24]. Штаммы A. tumefaciens с мутациями ChvA и ChvB непатогенны, поскольку не способны прикрепляться к растительным клеткам. Описан мутант ChvD, аттенуированный по экспрессии гена virG и аттенуированный по вирулентности. Мутация ChvH привела к снижению вирулентности из-за снижения экспрессии многих генов vir, включая VirB9, VirB10, VirB11, VirG и VirE. ChvG/I – двухкомпонентная регуляторная система, индуцированная низким pH, который активирует экспрессию регулятора транскрипции Vir. Белок ChvE играет роль в передаче сигналов VirA/G и связывается с переносчиками сахара, а также с белками хемотаксиса. Однако только несколько модельных штаммов (например, C58 и A6) использовались для характеристики этих механизмов патогенеза. Это дает ограниченное представление о генетическом разнообразии вирулентных штаммов A. tumefaciens. Важно получить всесторонние знания о лежащей в основе генетической основы вирулентности путем проведения сравнительного геномного анализа ряда генетически разнообразных штаммов A. tumefaciens [25].
Система секреции типа VI (T6SS).
Грамотрицательные бактерии развили различные замечательные и сложные системы секреции для выделения белков или молекул ДНК в окружающую среду. К хорошо изученным системам секреции относятся I-VI типы. Многие фитопатогенные грамотрицательные бактерии обладают системой секреции типа III (T3SS), которая секретирует эффекторы в цитоплазму клетки-хозяина. Многие виды родов Pseudomonas, Ralstonia, Erwinia и Xanthomonas содержат хорошо охарактеризованные T3SS [26]. T3SS служит важным механизмом вирулентности для многих бактериальных патогенов, заражающих растения-хозяева [27]. Вирулентные штаммы A. tumefaciens обладают T4SS, который экспортирует молекулы Т-ДНК и белковые эффекторы в растение-хозяин, что приводит к образованию опухоли [28,29]. Недавно охарактеризованный T6SS также присутствует в штаммах A. tumefaciens [30]. Однако мало что известно о распространении и генетическом разнообразии T6SS штаммов у A. tumefaciens, в основном тех, которые поражают производство грецкого ореха в Калифорнии. T6SS впервые был охарактеризован как секреторный аппарат Pseudomonas aeruginosa, где он, как известно, экспортирует белок ко-регуляции гемолизина (Hcp1). Позднее эта система секреции была обнаружена более чем в 25% геномах грамотрицательных бактерий [31]. Эта широко консервативная многокомпонентная наномашина структурно связана с сократительными фаговыми хвостами [32,33]. Это одна из многих специализированных систем секреции, которые бактерии используют для транспортировки белков и других факторов в окружающую среду и к другим микробам. T6SS может функционировать либо контактно-зависимым [34,35], либо контактно-независимым образом, чтобы конкурировать с другими микробами [28,36]. В модельном штамме A. tumefaciens C58 область, кодирующая T6SS, состоит из двух по-разному транскрибируемых оперонов. Одним из них является imp оперон, состоящий из 14 генов (от atu4343 до atu4330) [37], одиннадцать из которых считаются ключевыми для T6SS у протеобактерий. Другой — оперон hcp, кодирующий 9 генов (от atu4344 до atu4352), четыре из которых являются ядерными для T6SS у протеобактерий [22]. Одно исследование, оценивающее T6SS одиннадцати штаммов A. tumefaciens, показало, что локусы imp консервативны, тогда как гены в опероне hcp более вариабельны, включая vgrG [38]. 11 штаммов представляют 4 геномных вида A. tumefaciens и 6 различных типов оперонов hcp. Кроме того, в некоторых штаммах Agrobacterium также присутствуют локус 2 vgrG2, локус 3 vgrG и локус 4 vgrG. Поскольку T6SS важен для бактерий, чтобы конкурировать за экологические ниши, разнообразие T6SS в одиннадцати штаммах, выделенных из различных источников, позволяет предположить, что T6SS может способствовать адаптации штаммов-хозяев к данной среде [38].
Методы борьбы с корончатым галлом на плантациях грецкого ореха
Борьба с корончатым галлом долгое время была проблемой во всем мире из-за широкого круга хозяев и уникального механизма патогенеза. Чтобы справиться с болезнью корончатого галла, производители полагаются на фумигацию почвы, выбраковку зараженных деревьев или на хирургическое удаление опухолевой ткани. Эти методы имеют ограниченную эффективность, являются дорогостоящими и трудоемкими. Штамм биоконтроля A. radiobacter K84 [39] показал себя многообещающим в борьбе с корончатым галлом, когда о нем впервые сообщили в 1972 г. New & Kerr [40], и он использовался для лечения корончатого галла во многих странах. Штамм K84 продуцирует бактериоцин под названием агроцин84, который ингибирует синтез ДНК или РНК чувствительных вирулентных штаммов A. tumefaciens. Агроцин84 кодируется генами, расположенными на плазмиде pAgK84. Однако pAgK84 может быть приобретен вирулентными штаммами, в результате чего эти штаммы становятся устойчивыми к штамму биоконтроля K84. Чтобы решить эту проблему, был сконструирован мутант pAgK84 по Trade-делеции, и было показано, что он значительно снижает передачу pAGK84 вирулентным штаммам, при этом снижая образование галлов у восприимчивых хозяев. Горизонтальный перенос гена pAgK84 является одним из механизмов, благодаря которому вирулентные штаммы A. tumefaciens становятся устойчивыми к штамму биоконтроля K84. Характеристика генов катаболизма опинов, расположенных в опероне acc, свидетельствует о том, что мутации в гене accF также приводят к устойчивости к штамму К84. Оперон acc состоит из 8 генов, названных accR, и от accA до accG, экспрессия которых индуцируется агроцинопинами [39]. Теоретически штаммы, несущие ген агроцинопинсинтазы, чувствительны к K84 из-за мимикрии агроцинопина с помощью агроцин84, что делает возможным его поглощение вирулентными штаммами. Таким образом, вирулентные штаммы станут чувствительными к штамму К84 [41]. Однако исследования эффективности штамма K84 в регионе выращивания грецкого ореха в Калифорнии показали, что штаммы, устойчивые к K84, широко распространены. Однако механизм резистентности этих штаммов не ясен [42]. На сегодняшний день на рынке не существует широко эффективных бактерицидов для послепосевной борьбы с корончатым галлом грецкого ореха.
Предпосевные обработки против корончатого галла также широко используются во всем мире [4]. Несмотря на широкое использование бромистого метила в качестве предпосевного фумиганта, все еще встречается корончатый галл. Несколько исследований пришли к выводу, что бромистый метил неэффективен для сокращения вирулентных популяций A.tumefaciens в почве; однако в этих исследованиях популяции вирулентных A. tumefaciens оценивали косвенно, либо путем наблюдения за развитием болезни, либо с использованием сред с ограниченной способностью селективно культивировать A. tumefaciens с использованием отмеченного штамма A. tumefaciens, устойчивого к антибиотикам, наряду с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), основанная на тесте для проверки вирулентности. В недавнем исследовании непосредственно измерялись популяции A. tumefaciens до и после фумигации бромистым метилом [37]. Это исследование пришло к выводу, что многие предпосевные фумиганты эффективны для сокращения популяций A. tumefaciens, передающихся через почву, и предположило, что A. tumefaciens повторно заносится в почву через зараженный посадочный материал, таких как саженцы или семена [43]. Таким образом, борьба с корончатым галлом остается серьезной проблемой в ореховых садах во всем мире.
Будущие стратегии борьбы с корончатым галлом у грецкого ореха
На основе последних исследований, проведенных во всем мире, предложено несколько новых методов борьбы с корончатым галлом. Например, развитие генетической устойчивости с помощью новых подходов, таких как РНК-интерференция (РНК-интерференция) или вирус-индуцированное подавление экспрессии генов (virus-induced gene silencing, VIGS), может решить эти проблемы. Опосредованное подавление корончатого галла у грецкого ореха (Juglans regia L.) РНК-интерференцией было достигнуто ранее [44]. Кроме того, предполагается, что увеличение микробного разнообразия и активности в фумигированной почве обеспечит большую конкуренцию A. tumefaciens, тем самым снизив ее численность и ограничив заболеваемость [45].
Некоторые эксперименты показали, что микроклональное размножение является потенциальной технологией борьбы с заболеваемостью корончатым галлом. Клоновые подвои, размножаемые методом микроразмножения, показали значительно более низкие рейтинги корончатого галла, чем подвои сеянцев через 7 и 12 лет после посадки [46,47]. Родиной грецкого ореха считается Средняя Азия, в том числе и Узбекистан, и существует множество местных сортов и форм, которые демонстрируют сильные характеристики роста и продуктивности. Однако отмечено, что в садах, созданных на основе этих сортов, корончатый галл практически не встречается. По этой причине отбор сортов, устойчивых к A. tumefaciens, среди местных сортов с сильными характеристиками роста, а также их микроклональное размножение и использование на плантациях в качестве прививок также может помочь уменьшить распространение этого заболевания.
Заключение
Грецкий орех (Juglans regia L. ) выращивается во многих странах как ценное орехоплодное дерево, и его значение на мировом рынке с каждым годом возрастает. Однако сегодня плантации грецкого ореха сильно повреждены несколькими болезнями, такими как корончатый галл. Хотя для борьбы с корончатым галлом было разработано несколько биологических, химических и механических методов, они оказались недостаточно эффективными. По этой причине разработка методов борьбы с этим заболеванием и его возбудителем не потеряла своей актуальности. В будущем развитие генетической устойчивости с помощью новых подходов, таких как РНК-интерференция (РНКи), технологии вирус-индуцированное подавление экспрессии генов (virus-induced gene silencing, VIGS), увеличение микробного разнообразия и активности в фумигированной почве, а также микроразмножение будут лучшими стратегиями против корончатого галла на грецком орехе.